Pewarnaan Endospora Bakteri

Pewarnaan endospora menggunakan serangkaian pewarna, zat Malachite hijau untuk endospores  dan zat safranin warna pink  untuk sel vegetatif.
Uji diferensial untuk mengidentifikasi Bakteri Genus Bacillus  & Clostridium 

Pewarnaan endospora B. Subtilis (Spora Green)

Sebelum membahas prosedur untuk pewarnaan endospores, penting untuk mengetahui  sifat endospora 



John Tyndall, orang  Irlandia kelahiran Inggris pada abad ke-17 ,   seorang fisikawan yang membuat banyak kontribusi untuk ilmu pengetahuan, salah satunya adalah penemuan bahwa beberapa mikroba ada dalam dua bentuk:
             1. bentuk tahan panas  (endospores)
             2. bentuk peka panas  (sel-sel hidup vegetatif)

Tyndall menemukan bahwa   butuh pemanasan lama atau bertahap untuk menghancurkan bentuk mikroba yang tahan panas. Hasil dari penelitian ini adalah metode sterilisasi  dengan memanaskan ke titik didih pada 2 - 3 hari berturut-turut ("Tyndallization").

"Tyndallization" berguna untuk sterilisasi media pertumbuhan dan situasi lain di mana otoklaf ( instrumen yang menggunakan panas dan tekanan untuk mensterilkan) tidak tersedia

Apakah endospora itu? 

Endospores diproduksi oleh beberapa jenis bakteri  terutama genus Clostridium dan Bacillus.  Struktur pelindung ini dibuat untuk  menanggapi kondisi lingkungan yang ekstrim (seperti suhu tinggi, pengeringan, bahan kimia, perubahan pH dan kekurangan makanan).melalui proses yang dikenal sebagai sporulasi  

Dalam, bentuk menyandang endospora, bakteri tidak dapat memetabolisme atau mereproduksi, tetapi mirip  seperti benih tanaman. Ketika kondisi lingkungan kembali menjadi menguntungkan,   bakteri kembali ke  bentuk aktif (sel vegetatif).
  
Pewarnaan Endospores   bakteri 
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .
  Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

Protokol   pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:

   

- Letakkan slide bakteri di atas bak air yang dipanaskan
- Genangi  slide dengan larutan malachit green  yang sudah disaring, (sebagai pewarna utama), biarkan posisi
   slide tetap di atas bak air panas (seperti dikukus)  selama 5 menit, tambahkan larutan malachit jika  mulai
   mengering.
-  Angkat slide dari bak air dan bilas dengan air sampai tidak ada lagi pewarna yang tinggal.
-  Genangi slide dengan safrinin (counterstain) selama 20 detik dan kemudian bilas.
-  Lihat slide dengan mikroskop cahaya.(pembesaran 1000xTM, menggunakan minyak immersi)

Hasil Pengamatan :
Endospores akan tampak hijau,  karena mempertahankan warna utama, Malachite hijau . Sel-sel vegetatif   akan terlihat merah muda, karena menyerap safrinin.

Problem Interpretasi  pengecatan endospora 

Perlu dicatat bahwa setiap goresan kecil pada slide juga dapat terlihat hijau. Segala sesuatu  pada slide  yang terlihat hijau belum tentu sebuah endospora. Endospores itu kecil dan biasanya oval.,  adapun  gumpalan hijau besar atau tidak teratur   pada slide dapat dikatakan artefak

Sumber : http://pemburumikroba.blogspot.com